CCK-8試劑盒

Cell Counting Kit -8

檢測(cè)原理

CCK-8試劑盒是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。

WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品，能在電子載體1-甲氧基PMS的作用下被還原成水溶性甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，可以反映活細(xì)胞數(shù)量。

CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點(diǎn)：

★靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好

★操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力

★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞

★無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低

★為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用

★適合于高通量藥物篩選

CCK-8用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)

CCK-8方法的優(yōu)勢(shì)

CCK-8法與其他細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)比較

保存條件：

4oC避光保存一年有效， -20oC避光保存兩年有效。 避免反復(fù)凍融。

CCK-8試劑盒操作說明

CCK-8溶液可直接加到細(xì)胞中，不需要與其它組分預(yù)混。由于CCK-8溶液非常穩(wěn)定并且細(xì)胞毒性很小，所以可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間孵育，例如孵育24-48小時(shí)。

在進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)之前，可先設(shè)置空白對(duì)照孔，僅加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液，不加入細(xì)胞。

方法一. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量）

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞到培養(yǎng)板內(nèi)。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后按培養(yǎng)基體積的10%加入CCK-8試劑，培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。）

方法二. 細(xì)胞活性檢測(cè)

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

方法三. 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

1、在96孔板中加入90 μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5% CO2）。

2、向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

活力計(jì)算：

細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(不加藥)-A(空白)] ×100

A(加藥)：具有細(xì)胞、CCK 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

A(0 加藥)：具有細(xì)胞、CCK 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項(xiàng):

1，由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、 水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2，本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)， 所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測(cè)。如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。培養(yǎng)基中酚紅和血清的吸光度，在計(jì)算時(shí)通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

3，有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁(yè)面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。加完之后最好能夠離心，以免CCK-8液滴懸掛在壁上。用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。

4，若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

5，建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。若使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6，若沒有450nm的濾光片，可使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測(cè)靈敏度最高。

7，金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、CuSO4會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。

8，本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。